用于成骨的新型納米振動(dòng)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì) 構(gòu)建和表征

在再生醫(yī)學(xué)中，科學(xué)家們的目標(biāo)是顯著推進(jìn)可以控制干細(xì)胞譜系承諾的技術(shù)。例如，納米尺度的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的機(jī)械刺激可以激活機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以刺激2-D和3-D培養(yǎng)物中的骨生成(骨發(fā)育)。這種工作可以通過從自體或同種異體中產(chǎn)生移植材料來徹底改變骨移植手術(shù)MSCs的來源沒有化學(xué)誘導(dǎo)這種現(xiàn)象。由于對(duì)臨床使用的細(xì)胞的這種機(jī)械刺激的生物醫(yī)學(xué)興趣的增加，研究人員和臨床醫(yī)生都需要可擴(kuò)展的生物反應(yīng)器系統(tǒng)以提供始終可重復(fù)的結(jié)果。在現(xiàn)在發(fā)表在科學(xué)報(bào)告上的一項(xiàng)新研究中，Paul Campsie和生物醫(yī)學(xué)工程，計(jì)算，物理和分子，細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)系的多學(xué)科研究人員團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以滿足現(xiàn)有的要求。

新儀器包含一個(gè)用于生物反應(yīng)的振動(dòng)板，校準(zhǔn)和優(yōu)化1 kHz的納米振動(dòng)，一個(gè)產(chǎn)生30 nm振幅的電源單元和用于細(xì)胞生長的定制六孔培養(yǎng)器皿。培養(yǎng)皿包含磁性插入物，用于連接生物反應(yīng)器的磁振板。他們?cè)u(píng)估了成骨蛋白的表達(dá)，以確認(rèn)在系統(tǒng)內(nèi)的初始生物實(shí)驗(yàn)后MSC的分化。Campsie等人。進(jìn)行3-D凝膠構(gòu)造的原子力顯微鏡(AFM)以驗(yàn)證在振動(dòng)刺激期間不發(fā)生凝膠的應(yīng)變硬化。結(jié)果證實(shí)細(xì)胞分化是僅由生物反應(yīng)器提供的納米振動(dòng)刺激的結(jié)果。

由于與骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等年齡相關(guān)的病癥引起的骨骼損傷的發(fā)生率增加是人類生命消耗質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。增加骨密度或骨折愈合的治療方法的發(fā)展是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)再生潛能的主要目標(biāo)。研究人員已經(jīng)證明了使用幾種方法(包括被動(dòng)和主動(dòng)策略)通過機(jī)械刺激控制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨(骨骼發(fā)育)。被動(dòng)方法通常改變基底形貌以影響細(xì)胞粘附特征，而主動(dòng)方法包括暴露于來自外部來源的各種力。

在ANSYS工作臺(tái)17.1中進(jìn)行有限元分析，以確定十三和十五壓電陣列頂板布置上1kHz的諧波響應(yīng)。(A)十三個(gè)壓電陣列圖。(B)十五個(gè)壓電陣列圖。(C)在1kHz下預(yù)測十三個(gè)壓電陣列的納米級(jí)位移。(D)在1kHz下預(yù)測十五個(gè)壓電陣列的納米級(jí)位移。圖片來源：科學(xué)報(bào)告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人目前的工作。打算在MSC的受控骨生成的預(yù)先存在的設(shè)計(jì)上取得進(jìn)展，以構(gòu)建適用于小規(guī)模臨床試驗(yàn)的良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)兼容系統(tǒng)。在建造時(shí)，該團(tuán)隊(duì)使用激光干涉儀精確測量生物反應(yīng)器頂板和用于培養(yǎng)器皿的井內(nèi)的振動(dòng)位移，以驗(yàn)證他們基于有限元分析(FEA)模型開發(fā)的設(shè)備。該團(tuán)隊(duì)使用直接數(shù)字合成波形 (DDS)發(fā)生器和重建濾波器，用于去除DDS輸出的高頻分量，從而產(chǎn)生1 kHZ的純正弦波輸出，以實(shí)現(xiàn)精確的納米振動(dòng)。

研究小組通過進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)來量化生物反應(yīng)器系統(tǒng)的運(yùn)行，以量化暴露于納米振動(dòng)刺激的MSC的成骨蛋白表達(dá)。他們對(duì)實(shí)驗(yàn)中使用的膠原凝膠進(jìn)行了AFM測量，以確定從培養(yǎng)皿傳遞到凝膠中的振動(dòng)。然后他們表明，凝膠的剛度對(duì)于發(fā)生的納米振動(dòng)沒有顯著增加。

不同劑量的等離子體處理后的PP培養(yǎng)器皿的水接觸角測量和在PP和聚苯乙烯(PS)6孔板上的MG63細(xì)胞(成骨細(xì)胞)的顯微鏡圖像。等離子體處理(A)后的WCA測量曲線顯示，需要至少30秒才能將WCA顯著改變至允許細(xì)胞粘附和增殖的水平。(B)血漿處理前PP63孔板上MG63細(xì)胞不粘附的圖像，(C)血漿處理的PP6孔板上MG63細(xì)胞的粘附和增殖，和(D)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的MG63細(xì)胞康寧PS 6孔板。圖片來源：科學(xué)報(bào)告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人。構(gòu)建了具有特定材料選擇和培養(yǎng)器附件的生物反應(yīng)器，以在1Hz和5kHz的頻率之間提供最佳的納米級(jí)振動(dòng)。它們確保裝置的共振頻率遠(yuǎn)高于操作頻率，以防止共振放大或阻尼。為了確定設(shè)備的適當(dāng)尺寸，研究團(tuán)隊(duì)使用ANSYS Workbench軟件執(zhí)行了FEA ?？茖W(xué)家通過使用13到15個(gè)壓電陣列以低成本創(chuàng)造了生物反應(yīng)器為了它的建設(shè)。產(chǎn)品設(shè)計(jì)允許細(xì)胞的最小和最大位移的不同交替帶，以在整個(gè)培養(yǎng)器皿中接收不一致的振動(dòng)水平。該團(tuán)隊(duì)估計(jì)了壓電致動(dòng)器和其他設(shè)備組件的固有共振頻率，以了解它們對(duì)實(shí)驗(yàn)裝置的影響。

然后，研究小組使用等離子體表面活化來改變塑料培養(yǎng)器皿的表面化學(xué)，以幫助細(xì)胞粘附和增殖，從而增加聚合物的表面能。在空氣等離子體處理五分鐘后，他們培養(yǎng)人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞以觀察細(xì)胞與培養(yǎng)器皿的附著增加。他們測量了聚合物的水接觸角，以確定改性的表面能和表面潤濕性?？茖W(xué)家們展示了聚合物培養(yǎng)皿等離子體活化的原理驗(yàn)證及其對(duì)有利細(xì)胞附著的表面潤濕性的影響。他們的目標(biāo)是進(jìn)一步開發(fā)培養(yǎng)皿表面，以確保其穩(wěn)定性和保質(zhì)期。

TOP：生物反應(yīng)器振動(dòng)板，注塑成型PP 6孔培養(yǎng)皿。(A)改進(jìn)型生物反應(yīng)器具有較輕的底座，提手和凹底板，以及設(shè)計(jì)用于輸出1 kHz和30 nm位移幅度的正弦波的電源。(B)注射成型的PP培養(yǎng)器皿，在每個(gè)孔的底部裝有halbach鐵氧體環(huán)形磁鐵?？蚣芎涂妆诘暮穸葹?.5毫米。BOTTOM：干涉儀測量設(shè)置和輸出信號(hào)。(A)為了測量納米級(jí)位移，干涉儀發(fā)射來自激光頭的激光束，該激光束被反射回被測物體上的光電探測器(也在激光頭內(nèi))。對(duì)產(chǎn)生的光學(xué)干涉圖案的分析允許獲得位移。(B)由干涉儀測量的時(shí)間序列數(shù)據(jù)的示例。(C)時(shí)間序列數(shù)據(jù)的FFT分析示例?？汕宄乜吹缴锓磻?yīng)器的1kHz峰值，并且在750Hz處也存在大的峰值，然而，該信號(hào)由干涉儀的參考鏡產(chǎn)生，該參考鏡在固定頻率下恒定激發(fā)以獲得控制信號(hào)。圖片來源：科學(xué)報(bào)告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

研究團(tuán)隊(duì)在目前的工作中顯著改進(jìn)了生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，與之前提出的原型相比，形成了更輕的基礎(chǔ)。他們使用AD9833電源波形發(fā)生器進(jìn)行電源調(diào)節(jié)，并且可以輕松調(diào)節(jié)并保持適當(dāng)?shù)臑V波，以獲得純1 kHz正弦波驅(qū)動(dòng)信號(hào)。研究人員獲得了濾波前和濾波后信號(hào)的功率譜，以估算發(fā)生器的功率譜密度。他們使用激光干涉儀驗(yàn)證了生物反應(yīng)器的FEA建模和校準(zhǔn)，以確定位移的納米級(jí)變化?？茖W(xué)家們使用粘合在每個(gè)井底面的棱柱形反射帶來測量與生物反應(yīng)器磁性連接的培養(yǎng)皿孔尺寸。

該技術(shù)具有巨大的空間，可以從接種在膠原凝膠中的MSCs中生成三維礦化基質(zhì)，形成骨骼支架。例如，培養(yǎng)的細(xì)胞在振動(dòng)期間接受周期性加速力，其作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架以誘導(dǎo)骨生成。該效應(yīng)還可能與細(xì)胞培養(yǎng)基中的環(huán)境剛度有關(guān)，影響干細(xì)胞分化并誘導(dǎo)MSC中的骨生成。為了區(qū)分原因，Campsie等人。當(dāng)他們對(duì)膠原凝膠進(jìn)行納米振動(dòng)時(shí)，使用AFM來檢測剛度的任何變化。他們沒有觀察到凝膠內(nèi)應(yīng)變硬化的顯著影響和楊氏模量保持軟膠原凝膠的值 ; 因此，將細(xì)胞分化歸因于單獨(dú)的納米振動(dòng)。

TOP：納米振動(dòng)過程中膠原凝膠的AFM測量。(A)將振動(dòng)壓電致動(dòng)器連接到含有膠原凝膠的培養(yǎng)皿上，AFM懸臂用于測量振動(dòng)期間凝膠硬度的任何變化。(B)通過AFM評(píng)估在三種不同壓電振幅下納米振動(dòng)的膠原樣品的楊氏模量。數(shù)據(jù)是平均值±SD(n> 30)。底部：納米振動(dòng)刺激三周時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)。以1kHz和30nm置換的頻率與未刺激的對(duì)照一起刺激細(xì)胞三周。相對(duì)于靜態(tài)對(duì)照測量RUNX2，OSX，OPN，OCN和ALP的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用LI-COR Odyssey系統(tǒng)(LI-COR，Nebraska，USA)定量。與未刺激的對(duì)照相比，在機(jī)械刺激的樣品中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高的表達(dá)(由紅色虛線表示)。數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 4，stats Mann Whitney U-檢驗(yàn)* p <0.05。圖片來源：科學(xué)報(bào)告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

在納米振動(dòng)期間，細(xì)胞經(jīng)歷分化以形成通過相對(duì)于骨發(fā)育適度上調(diào)基因而觀察到的成骨譜系。由于骨相關(guān)蛋白表達(dá)更多地是這種轉(zhuǎn)換的明確指標(biāo)，科學(xué)家們測試了納米振動(dòng)3周，刺激與未刺激的MSCs對(duì)已知的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)。他們觀察了Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)，osterix(OSX)，骨橋蛋白(OPN)，骨鈣素(OCN)和堿性磷酸酶的表達(dá)(ALP)蛋白質(zhì)，與未刺激的對(duì)照相比。成骨分化的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的表達(dá)表明新設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器成功刺激MSC成骨的能力。

通過這種方式，Paul Campsie及其同事開發(fā)了一種生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)在研究項(xiàng)目或小型臨床試驗(yàn)的規(guī)模上發(fā)揮了充分的作用。該設(shè)備提供機(jī)械刺激，振幅接近30nm，頻率為1kHz。為了應(yīng)對(duì)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)控制骨骼研究中細(xì)胞行為和干細(xì)胞分化的興趣日益增長，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，以提供更廣泛的頻率范圍。這項(xiàng)新工作將開啟一個(gè)全新的機(jī)械生物學(xué)領(lǐng)域，通過'nanokicking刺激其他細(xì)胞類型具有無法預(yù)料的潛力“未來的工作將集中在改進(jìn)的系統(tǒng)上，以便為更大量的細(xì)胞提供機(jī)械刺激。